Detección cualitativa de los genes N y ORF1ab de SARS-CoV-2 mediante RT-PCR multiplex a tiempo real en muestras respiratorias de pacientes de COVID-19.

La muestra clínica recomendada para realizar estos análisis es exudado nasofaríngeo y, de no ser posible, muestra orofaríngea, ya que diferentes estudios indican que la concentración de virus es menor en esta última. La cantidad del virus va aumentando en la nasofaringe y orofaringe desde el momento de la infección hasta el séptimo día aproximadamente, momento en el que empieza a disminuir. Para ello, se utiliza un hisopo fino y flexible del kit específico para toma de muestras respiratorias para virus que se introduce bien por ambas narinas, paralelo al paladar, y se mantiene durante 5 segundos en la rinofaringe, o bien por la boca, sujetando la lengua con un depresor, hasta la orofaringe durante 5 segundos. El objetivo es conseguir un frotis con suficientes células de epitelio mucoso infectadas con el virus. Los hisopos se introducen inmediatamente en tubos estériles que contienen 2-3 ml de medio de transporte viral. Estos tubos se pueden mantener hasta 48 horas refrigerados a 2-8ºC hasta su procesamiento. La extracción en nuestro laboratorio la realiza personal médico cualificado.

EL TIEMPO DE RESPUESTA ES DE 24/48 HORAS DESDE LA

EXTRACCIÓN/RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS

¿Qué es la PCR?

Las PCR (siglas en inglés de “Reacción en Cadena de la Polimerasa”), son un tipo de pruebas de diagnóstico que se llevan utilizando durante años en diferentes crisis de salud pública relacionadas con enfermedades infecciosas. Estas pruebas se están usando desde los primeros días del estallido de la pandemia de coronavirus en España.

Al realizar una prueba de diagnóstico mediante PCR, lo que permite detectar es un fragmento del material genético de un patógeno o microorganismo. La PCR, cuyo uso es común y rutinario en los laboratorios de Microbiología de hospitales, centros de investigación y universidades, se basa en las características de estabilidad al calor de una enzima polimerasa.

Tras el análisis de una muestra respiratoria de una persona sospechosa de estar infectada, si la prueba detecta ARN del virus, el resultado es positivo. Así, se sabría que ese paciente tiene COVID-19. En cambio, si la técnica de PCR no detecta el material genético del virus, la persona no estaría infectada.

El diagnóstico a través de PCR presenta cierto grado de complejidad. Requiere personal entrenado y preparado para su correcta realización. Las PCR tienen tres características básicas:

  • Alta especificidad: puede diferenciar entre dos microorganismos muy cercanos evolutivamente.
  • Alta sensibilidad: puede detectar cantidades de 20 copias/ml -o incluso menos- de material genético viral.
  • Precoz: se detecta el virus en las primeras fases respiratorias.

En Lorgen llevamos a cabo un estudio de RT PCR multiplex a tiempo real para la detección cualitativa del gen N (mix-1) y el gen ORF1ab (mix-2) del SARS-CoV-2. El kit incluye oligonucleótidos y mezclas de sondas específicas del SARS-CoV-2 y pueden ser detectados a través del canal FAM. La sonda de control interno puede detectarse en el canal VIC. La detección se realiza mediante RT PCR multiplex a tiempo real en un solo paso: La transcripción inversa (RT) y la amplificación del cADN ocurre en un único tubo de reacción. Se incluye un control positivo (plásmido recombinante) como control positivo de la reacción de PCR de Mix-1. Se incluye un control positivo (plásmido recombinante) como control positivo de la reacción de PCR de Mix-2. El control positivo indica que la Taq polimersa, los oligonucleótidos y las sondas de SARS-CoV-2 funcionan correctamente en ese experimento.

El test de sensibilidad se ha realizado con ARN de coronavirus (cultivo celular) de la cepa «BetaCoV/Germany/BavPat1/2020 p.1 (1) siendo la sensibilidad del:

  • 100% para 50 copias.
  • 90% para 10 copias.
  • 75% para 5 copias.

El test de especificidad se ha realizado analizando diferentes ARN:

  • ARN de SARS Co-V de la cepa Urbani a 1 ng and 5 ng.
  • Plásmido recombinante de SARS a 106 copias.

No se han observado detecciones inespecíficas por lo que se considera una especificidad analítica del 100%.

La sensibilidad y especificidad diagnóstica de la técnica utilizada por Lorgen se han determinado en un panel de 80 muestras anonimizadas del biobanco del Centro Nacional de Microbiología (Instituto de Saludo Carlos III) con 26 muestras positivas y 54 muestras negativas. El análisis de resultados mostró una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100%.

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